ВведениеМобильные генетические элементы (далее – МГЭ) представляют собой генетические факторы, способные перемещаться внутри генома эукариот и оказывать влияние на частоту спонтанного мутирования. Содержание их ДНК в геномах эукариот варьирует от 30 до 80 %. Их функции в клеточном геноме неоднозначны – они могут одновременно вести себя и как внутриклеточные стрессоры, приводящие к необратимым изменениям генетического материала (двойным разрывам ДНК, мутациям) [1], и как источники адаптивной генетической изменчивости [2]. Адаптивные свойства МГЭ связывают с их способностью влиять на экспрессию генов, отвечающих за стрессоустойчивость организма [3, 4]. На сегодняшний день все бóльший интерес исследователей привлекает транспозоновая теория старения, которая предполагает, что эпигенетически подавленные МГЭ становятся вредными, поскольку клеточные механизмы защиты и контроля ухудшаются с возрастом [5]. Кроме того, доминирует мнение, что на генетическом уровне предрасположенность к заболеваниям зависит от изменений линейной структуры ДНК в результате мутаций, в основе которых лежат не только делеции, тандемные дупликации, амплификация генов, но и транспозиции МГЭ. Установлена причинно-следственная связь между различными заболеваниями (гемофилия, нейрофиброматоз, рак, психические расстройства) и активностью ряда МГЭ, в частности транспозонов [6–9]. У человека ДНК транспозонного происхождения составляет 54 % [10]. При одновременном воздействии внешнесредовых факторов и их индукции происходит увеличение темпа мутирования, числа геномных перестроек и, вследствие этого, возникновение определенных возраст-зависимых заболеваний [10, 11]. У Drosophila melanogaster процесс старения сопровождается нарушением репрессивной структуры гетерохроматина и повышением уровня экспрессии репортерных генов. Считают, что поддержание репрессивной структуры гетерохроматина и сохранение неактивного состояния МГЭ может оказаться ключевым для предотвращения МГЭ-обусловленных повреждений и улучшения тем самым качества жизни [12]. Имеется ряд противоречащих друг другу литературных данных, свидетельствующих, с одной стороны, об увеличении транспозиционной активности МГЭ с возрастом, и, с другой – об их снижении или неизменной активности в процессе старения. В многочисленных работах с применением разных организмов (дрожжи, нематода, дрозофила, мыши) и культур клеток человека установлено повышение активации МГЭ при старении [13–19]. На D. melanogaster показано, что с возрастом может происходить снижение транспозиций и количества копий некоторых МГЭ, что благоприятно сказывается на эмбриональной выживаемости и фертильности [2, 20]. В экспериментах по изучению молекулярных основ спонтанной эпигенетической защиты от массовых перемещений I ретроэлементов показано, что их высокая транспозиционная активность репрессируется при старении или обработке повышенной температурой реактивных I-самок [20]. Данный факт открыт и для Р транспозонов, индуцирующих дисгенные нарушения по типу Р-М [2]. Однако уровень их активности был исследован лишь у 2–4 и 21-суточных дисгенных самок. Отметим, что с возрастом также преобладают процессы деметилирования, которые приводят к хромосомным перестройкам за счет активации МГЭ [21]. Р элементы перемещаются с участием кодируемых ими ферментов транспозаз. Перемещения Р элементов происходят по механизму “разрезания и вставки”. Важную роль в ранней стадии Р-транспозиции играет кофактор GTP (гуанозинтрифосфат), который требуется для спаривания двух концов Р элемента перед ДНК эксцизией [22]. Дестабилизируя таким образом геном, транспозиции Р элементов приводят к нарушениям в функционировании клеток, что, в свою очередь, может вызывать различные патологические процессы репродуктивной системы и преждевременное старение. Более того, повышенный интерес к данным транспозонам вызван тем, что они широко распространены в популяциях дрозофилы и имеют гомологов у позвоночных животных (Pgga, Pdre) и человека (Phsa) [23]. Известна высокая функциональная гомология домена THAP (Thanatos-ассоциированный белок, названный также TNP (N-терминальный сайт-специфический ДНК-связывающий домен транспозазы Р элемента)) дрозофилы с доменом человека THAP9 [22]. В геноме человека 12 генов содержат THAP-домен. Только THAP9 проявляет исключительные гомологию к TNP дрозофилы и транспозазную активность в отношении Р элементов. Он может мобилизовать Р элементы как в клетках дрозофилы, так и в клетках человека. На сегодняшний день неизвестны функции THAP9 в качестве домена, связывающего транспозазу человеческого транспозона.D. melanogaster является удобным объектом исследования возраст-зависимых изменений дисгенной активности МГЭ, поскольку имеет определенные генотипы/цитотипы (с наличием/отсутствием функциональных копий транспозонов), при комбинации которых можно произвести массовую индукцию транспозиций МГЭ. В связи с этим цель настоящей работы – изучение влияния индуцированной активности Р транспозонов на старение-ассоциированные показатели репродуктивной системы и эмбриональную выживаемость D. melanogaster.Материалы и методыВ экспериментах использованы линии, полученные из коллекции Университета штата Индиана (Блумингтон, США): Harwich (Har) – строгая P-линия дикого типа, имеющая в генотипе функциональные копии Р элемента и отличающаяся свойствами индукторной линии в Р-М системе гибридного дисгенеза (ГД) [24]; Canton-S (CS) – М-линия дикого типа, не содержащая в генотипе Р элементы [25] и характеризующаяся как реактивная линия в Р-М типе ГД [24].С целью получения особей с высоким уровнем активности Р элементов в гонадах (Har [CS] ), самцы Har были скрещены с самками CS. Уровень индукции транспозиций Р элементов и обусловленной ими атрофии гонад является температурно-зависимым показателем. Максимальная активность транспозонов наблюдается при температуре +29 ºС, самая низкая – при +24 ºС [24]. Чтобы исключить полную стерильность дисгенных особей (с функциональными Р элементами) в работе применяли оптимальный температурный режим +25 ºС, при котором транспозиционная активность Р элементов приводит к 25–40 %-ному уровню атрофии гонад [26]. Особи, полученные в результате реципрокного скрещивания (CS[Har] ), были использованы в качестве контроля и обозначены как недисгенные особи без Р элементов. Для контроля за уровнем возраст-зависимой индукции Р элементов проведены тесты на атрофию гонад (далее – АГ)/стерильность и мутабильность локуса singed-weak (sn[w] ). Тест на АГ основан на визуализации морфологии гонад (односторонней (А1) и двусторонней (А0)) гибридных самок. Стерильность рассчитана по формуле: АГ (%) = А0 (%) + ½ А1 (%) [27]. В первой серии эксперимента проведен анализ АГ у 30–50 стареющих дисгенных/недисгенных самок F1 в трех повторностях опыта. Во второй серии эксперимента использованы 30–50 пар родительских особей каждой возрастной группы на экспериментальный вариант. Родители каждой возрастной группы отобраны для процедуры индивидуального индуцирующего и реципрокного скрещиваний, длительность которых составила двое суток. В результате индивидуальных скрещиваний (в трех повторностях опыта) получено женское потомство F1. Все самки F1 (30–100 особей), полученные от этих скрещиваний, подвергались оценке морфологии гонад в зависимости от возраста их родителей. У старых особей (в возрасте 40–60 суток) яйцепродукция находилась на низком уровне, поэтому количество вылетевших из куколок гибридных самок F1 колебалось в пределах 30–40 особей на повторность. Перед проведением теста на АГ все дисгенные/недисгенные самки поддерживались на питательной среде в течение трех суток для полного созревания их гонад. В данной работе атрофия гонад самцов не исследована.Мутабильность локуса sn[w] анализировали по методу [28], позволяющему оценить транспозиционную активность полноразмерных Р элементов. Для этого одновозрастных гибридных самцов F1, взятых из исследуемых вариантов, массово скрещивали с самками тестерной линии sn[w] (генотип: y[1]sn[w]/Yy+;bw[1];st[1] ) при температуре +29 °С. Линия sn[w] несет два дефектных Р элемента в локусе singed briste и имеет М-цитотип. Далее проведено индивидуальное скрещивание с самцами F1 и виргинными самками ywf/mei-41 (генотип: mei-41/y&C(1)DX;y[1]w[1]f[1]/y) при температуре +25 °С. Линия ywf/mei-41 имеет сцепленные X-хромосомы и морфологические признаки y (yellow – желтое тело), f (forked – недоразвитые щетинки) и w (white – белые глаза). Потомство F2 проанализировано на наличие особей, несущих мутации sn[w] (опаленные щетинки), sn[e] (extreme singed – сильно выраженный признак, короткие изогнутые щетинки) и sn[+] (pseudowild-type – псевдодикий тип, нормальные щетинки). Общий уровень мутабильности локуса sn[w] (Msn[w]) определен по отношению особей с признаками sn[e] и sn[+] среди всех подсчитанных мух [29]. Мутабильность локуса sn[w] изучена в пяти возрастных группах (5, 15, 35, 45 и 60 суток).Анализ плодовитости проведен путем индивидуального скрещивания виргинных дисгенных особей F1 обоего пола. На каждый флакон с питательной средой, подкрашенной активированным углем, отбирали по пять особей каждого пола и соответствующего возраста. Особей из каждой экспериментальной группы помещали на новую среду ежедневно в течение 10 суток. Подсчет эмбрионов вели через сутки под бинокуляром “МБС-10” (Россия). Во всех полученных кладках учитывали количество эмбрионов, отложенных самками за сутки. Плодовитость оценивали как среднее число эмбрионов на одну родительскую самку. Всего проанализировано 50–100 самок на вариант на повторность. В результате трех повторностей опыта изучено 150–300 особей на вариант.Эмбриональную выживаемость изучали одновременно с анализом показателя ‘’плодовитость’’. После подсчета количества яиц через 48 ч устанавливали количество развившихся эмбрионов. Выживаемость на эмбриональной стадии рассчитывали, как отношение числа развившихся эмбрионов к общему числу отложенных яиц. Данные основаны на результатах трех повторностей эксперимента и представлены в виде среднего значения и соответствующей стандартной ошибки среднего на вариант. Значимость влияния возраста на исследуемые показатели определяли однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA). Для анализа различий в анализируемых показателях в зависимости от возраста и дисгенных условий применяли двусторонний ANOVA. При значительной разнице (p<0,05) апостериорные попарные сравнения выполнены с использованием критерия Тьюки. Коэффициенты взаимодействия возраста и дисгенных условий и их достоверность найдены по формуле (Kw = ∆A(X; Y)/∆A(0; Y) + A(X; 0), где ∆A(X; Y) = A(X; Y) – A(0; 0) – превышение совместного действия факторов X (возраст) и Y (дисгенез) по сравнению с контролем; ∆A(0; Y) + A(X; 0) – сумма превышения эффектов при раздельном действии исследуемых факторов), приведенной в работе [30]. Статистическая обработка данных была проведена в программе Statistica (версия 7.0.61.0, StatSoft, Inc., США).Результаты и их обсуждениеАтрофия гонад и мутабильность локуса sn[w] считаются одними из важных признаков, указывающих на наличие и активность Р элементов в геноме дрозофилы. Проведены три повторности эксперимента (данные объединены), согласно которым, показано, что транспозиционная активность Р элементов находится на одном и том же высоком уровне независимо от возраста стареющих самок F1 (рис. 1А).В контроле показатель “атрофия гонад” варьировал от 2.1 до 4.3 %, что укладывается в нормы, наблюдаемые при спонтанной стерильности. Однако активность Р элементов зависела от возраста родителей, участвующих в дисгенных скрещиваниях. Наибольшая стерильность (3.4–56.3 %) была зафиксирована у дисгенных самок (p<0.05-0.001), полученных от родителей в возрасте 30–60 сут  (рис. 1Б). Известно, что стерильность особей в условиях Р-М дисгенной системы является следствием гибели клеток зародышевой линии на ранних стадиях онтогенеза. Это приводит к отсутствию половых клеток в гонадах самцов и самок, что является причиной общего недоразвития их у потомков F1 [22]. Наблюдаемая атрофия гонад у потомков, зависящая от старения родителей, очевидно, вызвана так называемым «эффектом возраста родителей». Этот эффект выражается в накоплении повреждений генетического материала в родительских половых клетках, приводящий к появлению у потомства врожденных аномалий. Такие повреждения ДНК, индуцированные в процессе старения и/или различными ДНК-повреждающими агентами (облучением, токсическими веществами), могут служить дополнительным триггером активности МГЭ [31]. Таким образом, возраст-ассоциированная активация Р элементов у родителей способна активировать пути клеточной гибели в дисгенных зародышевых клетках, что приводит к повышению атрофии гонад у их потомства.Результаты анализа мутабильности локуса sn[w] свидетельствуют о наличии активных копий Р элемента во всех возрастных дисгенных группах (рис. 2). Активность Р элементов практически неизменна у особей в возрасте 5–45 сут и возрастает лишь у 60-суточных особей (p<0.05).Средняя плодовитость дисгенных самок была статистически значимо ниже (p<0.05–0.01, односторонний ANOVA) таковой у недисгенных особей и не зависела от возраста (рис. 3В). Однако результаты ее посуточной динамики показали, что у 45- и 60-суточных дисгенных особей уровень плодовитости на протяжении 10 сут находится на низком уровне (p<0.05, односторонний ANOVA) по сравнению с 5-суточными особями этого же генотипа (рис. 3Б). В отличие от самок с Р элементами, плодовитость самок без Р транспозонов изменялась с возрастом (рис. 3А). Начиная с 30-суточного возраста репродуктивные функции самок либо имели тенденцию к снижению, либо статистически значимо были снижены (p<0.05, односторонний ANOVA). Двусторонний тест ANOVA выявил статистически значимые различия в продукции эмбрионов между дисгенными и недисгенными генотипами (p<0.0000) и в зависимости от возраста испытуемых (p<0.0000). Взаимодействие “Дисгенные условия и возраст” также было статистически значимым (p<0.0000). Процедура попарного сравнения между недисгенными и дисгенными вариантами с использованием апостериорного критерия Тьюки позволила обнаружить значительное снижение плодовитости дисгенных самок всех возрастных групп, кроме особей в возрасте 30, 50–60 сут.Результаты анализа средней эмбриональной выживаемости демонстрируют низкую (p<0.05–0.0000, односторонний ANOVA) жизнеспособность дисгенных эмбрионов по сравнению с недисгенными потомками (рис. 4В). Эмбрионы, полученные от 40–60-суточных родителей F1, имели статистически значимую низкую (p<0.05–0.001, односторонний ANOVA) среднюю выживаемость относительно потомков, отложенных молодыми родителями. Данные кривых посуточной динамики эмбриональной выживаемости показывают, что количество выживших эмбрионов, полученных от старых мух (50–60 сут), статистически значимо (p<0.05–0.0000, односторонний ANOVA) снижено или имеет нулевые значения (рис. 4Б). Двусторонний тест ANOVA выявил статистически значимые различия в эмбриональной жизнеспособности между дисгенными и недисгенными генотипами (p<0.0000) и в зависимости от возраста родителей (p<0.0000), а также во взаимодействии факторов “Дисгенные условия и возраст” (p<0.0000). Апостериорный критерий Тьюки для попарного сравнения между недисгенными и дисгенными вариантами обнаружил значительное снижение выживаемости дисгенных эмбрионов, полученных от всех возрастных родительских групп, кроме особей в возрасте 30 сут.Ранее показано [2], что высокая транспозиционная активация Р элементов характерна для молодых дисгенных самок (в возрасте двух-четырех суток), фертильность которых находилась на низком уровне. По мере старения репродуктивные функции дисгенных особей в возрасте 21 сут восстанавливались. Данные настоящего исследования не подтверждают результаты Ж.С. Хурана и его соавторов и демонстрируют низкую (невосстанавливающуюся) фертильность всех возрастных групп F1, претерпевающих активность Р элементов. Возможно, такая невоспроизводимость результатов связана с использованием в индуцирующих скрещиваниях различных реактивных линий (Canton-S и w1 ), отличающихся чувствительностью к инвазиям Р элементов. Считают [2], что репродуктивные функции дисгенных самок сохраняются, а в некоторых случаях восстанавливаются, за счет транспонирования резидентных элементов в кластеры пиРНК, являясь тем самым основой для создания новых пиРНК Р элементов. В результате полногеномного молекулярного исследования в яичниках дисгенных самок обнаружена сверхэкспрессия не только Р элементов, но высокие уровни экспрессии резидентных МГЭ из разных семейств. Резидентные элементы представляют собой транспозоны, которые постоянно присутствуют в геноме и являются общими для родительских форм. Резидентные элементы активируются в яичниках дисгенных самок, но не в семенниках дисгенных самцов [32]. Частота перемещения Р элементов в гонадах женского потомства в 15 раз выше, чем уровень транспозиций в гонадах самцов. Повышенная частота перемещений Р элементов у самок и связанная с ней индукция повреждений ДНК приводят к активации резидентных элементов. Подобный триггерный механизм был выявлен у D. virillis, у которой ретротранспозон Penelope в условиях дисгенеза приводит к активации четырех дополнительных семейств резидентных транспозонов [33]. Такие транспозоны вызывают разрывы ДНК, передающие сигналы для экспрессии резидентных элементов [34]. Повреждения ДНК, вызванные активностью Р элементов, могут запускать Chk2-зависимое фосфолирирование и убиквитин-зависимое разрушение Vasa, что, в свою очередь, нарушает организацию nuage – специфичная для зародышевой линии структура, участвующая в биогенезе пиРНК и молчании транспозонов [35]. В процессе старения дисгенных гибридов подавление транспозиционной активности может быть следствием возобновления сборки nuage и экспрессии белка Vasa. Возможен некий сценарий такой адаптации яичников к старению, заключающийся в том, что Р-элемент-индуцированные повреждения ДНК через определенную цепь событий приводят к сборке nuage, накоплению Vasa, продукции пиРНК и молчанию транспозонов. Очевидно, этот сценарий не работает в случае, когда дисгенные особи получены от стареющих родителей, вступающих в размножение с комплексом нарушенных механизмов, необходимых для репарации разрывов ДНК. Возникшие в результате этого повреждения ДНК блокируют пролиферацию стволовых клеток и оогенез, а также дают время для транспозиции резидентных элементов. Причиной невосстановления фертильных функций и высокой эмбриональной смертности дисгенных особей может быть также способность функциональных Р элементов подавлять экспрессию гена Myc, поддерживающего геномную целостность в зародышевой линии за счет элиминации клеток с накопленными генетическими повреждениями [36].С целью выяснения, какой из факторов (возраст и/или активность Р элементов) или их совместное действие в бóльшей мере влияет на исследуемые показатели, был применен расчет значений коэффициентов взаимодействия (таблица). Для всех изученных вариантов по всем исследуемым показателям прослеживается антагонистический эффект совместного действия факторов. Результаты дисперсионного анализа совместного действия возраста и индуцированной активности Р элементов на D. melanogaster показали статистически значимое влияние обоих изученных факторов как по отдельности, так и в их сочетании. Напротив, оценка коэффициентов взаимодействия выделила преимущественное действие индуцированной активности Р элементов на биологические эффекты. Неодинаковый вклад в наблюдаемые эффекты свидетельствует о различии механизмов биологического действия возраста и активации Р элементов.ЗаключениеТаким образом, в исследовании выявлено негативное воздействие активности Р элементов в условиях дисгенеза на возраст-зависимые изменения репродуктивной системы и эмбриональную выживаемость D. melanogaster. Отчетливая возрастная динамика Р элементов (по показателю “стерильность”) была обнаружена у потомков F1, полученных в дисгенных скрещиваниях от родителей разного возраста. Однако по мере старения дисгенных потомков F1 стерильность и фертильность не меняются с возрастом. Полученные результаты свидетельствуют, что с возрастом индуцированная транспозиционная активность Р элементов у D. melanogaster не меняется (по показателю “атрофия гонад”), но может влиять на возраст-ассоциированные показатели репродуктивной системы и выживаемость на ранних стадиях онтогенеза.