ВведениеСтарение представляет собой биологический процесс, характеризующийся снижением биологических функций организма и потерей устойчивости к стрессорам [1]. Организм перестает поддерживать постоянство внутреннего состояния, в результате чего становиться более восприимчивым к повреждающим воздействиям и развитию возрастных патологических процессов, обусловливающих ухудшение состояние здоровья и дальнейшее нарастание темпов старения. В конечном итоге это приводит к гибели [2, 3]. Таким образом, продолжительность жизни (далее – ПЖ) организма тесно связана с его стрессоустойчивостью. Ионизирующие излучения и прооксиданты оказывают значительное влияние на длительность жизни и темпы старения, вызывая изменения на всех уровнях организации, начиная с молекулярного. Они могут непосредственно повреждать макромолекулы, способствуют индукции нестабильности генома и изменению паттернов генной экспрессии, вызывают митохондриальную дисфункцию и метаболические нарушения, что приводит к выраженному токсическому эффекту на уровне тканей и органов. Реакция на эти факторы отражает общую жизнеспособность организма [4-6].Поиск средств, замедляющих темпы старения и стимулирующих стрессо- и радиоустойчивость, является актуальной задачей в настоящее время. Наиболее доступным способом замедления темпов старения представляется применение веществ, которые могут воздействовать на скорость старения и повышать сопротивляемость организма негативным воздействиям. Ранее были описаны вещества, которые являются потенциальными геропротекторами и антимутагенами [7]. Примерами таких веществ являются берберин и трихостатин А. Берберин – хорошо изученный природный алкалоид, для которого описано потенциальное действие против старения и развития ряда возрастзависимых заболеваний [8-11]. Он обладает антиоксидантной активностью [12], противоопухолевыми свойствами [13-15], обезболивающим [16] и противовоспалительным [17] действиями. Его биологические эффекты опосредованы несколькими сигнальными путями, включая NRF2/KEAP1, SIRT1, AMPK, IRS/PI3K/Akt/mTORC1, PTEN, GSK-3, NF-κB, JAK/STAT, MAPK [8, 10, 17–19], а также регуляцией метилирования ДНК и активности микроРНК [17, 19, 20].Трихостатин А является ингибитором гистондеацетилаз (HDAC) классов I и II и способен влиять на функционирование хроматина через ацетилирование гистонов, а также регулировать экспрессию микроРНК [21, 22]. Известно, что препараты, воздействующие на эпигенетические механизмы, включая ингибиторы HDAC, могут влиять на скорость старения организма и являются потенциальными средствами для лечения возраст-зависимых заболеваний [23].Ранее проведенные исследования показали положительное действие берберина и трихостатина А на ПЖ дрозофил и других модельных животных [24-30], но влияние данных веществ на устойчивость организма к генотоксическим факторам не описано. В данной работе мы исследовали влияние берберина и трихостатина А на продолжительность жизни и устойчивость Drosophila melanogaster к γ-излучению и прооксиданту параквату. Материалы и методыЛиния Drosophila melanogaster и условия содержания Исследование проводили на мухах линии дикого типа Canton-S (#64349), полученной из Дрозофилиного центра Университета Индианы (Блумингтон, США). Для каждого варианта эксперимента отбирали по 120–150 особей каждого пола в течение 24 ч после вылупления имаго. В эксперименте использовали самцов и оплодотворенных самок.Для содержания дрозофил применяли климатические камеры Binder KBF720-ICH (Binder, Германия). Особей содержали при температуре +25 °С, относительной влажности воздуха 60 % и 12-часовом режиме освещения. Состав питательной среды был адаптирован из работы Xia и de Belle [31]: вода – 1 л, кукурузная мука – 92 г, сухие дрожжи – 32.1 г, агар-агар – 5.2 г, глюкоза – 136.9 г.Исследуемые веществаВ эксперименте применяли растворы берберина (B3251, Sigma-Aldrich, США) в концентрациях 1; 10; 50; 100; 500; 1000; 5000 мкмоль/л и трихостатина А (T1952, Sigma-Aldrich, США) в концентрациях 0.1; 1; 10; 100 мкмоль/л. В качестве растворителя использовали 0.2 %-ный диметилсульфоксид (DMSO, D2650, Sigma-Aldrich, США) согласно рекомендациям изготовителя. Для DMSO в такой концентрации возможен токсичный эффект, но он не приводит к острой летальности у дрозофилы [32].При анализе ПЖ исследуемые вещества наносили на поверхность питательной среды в объеме 30 мкл на пробирку в течение всей жизни имаго. В качестве контроля использовали 0.2 % DMSO. В случае изменения устойчивости к параквату и гамма-излучению вещества давали в течение первых 15 сут жизни имаго.Анализ продолжительности жизниДля каждого эксперимента дрозофил собирали в течение 24 ч после вылета имаго из куколок. С использованием углекислотной анестезии (Genesee Scientific, США) мух усыпляли, сортировали по полу и рассаживали в пробирки по 30 особей. Начиная с первого дня жизни имаго ежедневно вели подсчет числа умерших особей, два раза в неделю мух переносили на свежую среду.Результаты представляли в виде кривых выживаемости Каплана-Майера и рассчитывали медианную ПЖ (длительность жизни наиболее типичных представителей выборки) и возраст 90 % смертности (показатель максимальной ПЖ). Для сравнения функций дожития использовали критерии Колмогорова-Смирнова [33] и Мантеля-Кокса [34].  Для оценки достоверности различий по медианной ПЖ применяли критерий Гехана-Бреслоу-Вилкоксона [35]. Для оценки статистической значимости различий возраста 90 % смертности использовали метод Ванг-Аллисона [36]. Обработку данных проводили с помощью программы Statistica, версия 6.1 (StatSoft, США), статистической среды R, версия 2.15.1 (The R Foundation) и онлайн-приложения OASIS 2 (Online application for survival analysis) [37]. Обработка паракватомПри проведении эксперимента мух содержали на среде, содержащей 2 % агар-агара и 5 % сахарозы и 20 ммоль/л параквата (#856177, Sigma-Aldrich). В эксперименте использовали мух в возрасте 15 сут. Мухи находились в стресс-индуцируемых условиях до конца жизни. Для оценки динамики гибели мушек по одной рассаживали в стеклянные капилляры диаметром 5 мм и анализировали в мониторе локомоторной активности DAM (Drosophila Activity Monitor, Trikinetics, США). Данные активности от отдельных мух были объединены в 30-минутные периоды и проанализированы. Погибших мух идентифицировали по полному отсутствию локомоторной активности. На основании полученных данных были построены кривые выживаемости. На каждый экспериментальный вариант анализировали по 32 особи в трех биологических повторностях.Условия облученияВ возрасте 15 сут дрозофил облучали в дозе 800 Гр с использованием γ-источника с Cs-137 «Исследователь» (СССР). При мощности дозы 0.74 Гр/мин продолжительность облучения составила 18 ч. Выбрана доза 800 Гр, так как она значительно снижает выживаемость имаго самцов и самок дрозофил без острого летального эффекта. После облучения мух помещали на стандартную питательную среду без добавления исследуемых веществ.Анализ экспрессии генов стресс-ответаОценку транскрипционной активности генов стресс-ответа проводили с применением метода ПЦР «в реальном времени» с этапом обратной транскрипции. Для каждого варианта эксперимента отбирали 10 особей каждого пола, которых предварительно содержали на среде с 0.2 % DMSO (контроль) или исследуемыми веществами в течение 15 сут. РНК выделяли с помощью набора Aurum Total RNA Mini (Bio-Rad, США) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию РНК измеряли с помощью набора для анализа РНК Quant-iT (Invitrogen, США) в соответствии с инструкциями производителя. кДНК была синтезирована в соответствии с набором для синтеза кДНК iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, США) из полученного раствора РНК. Реакционную смесь для ПЦР-реакции готовили на основе смеси qPCRmix-HC SYBR (Евроген, Россия) и праймеров (Евроген, Россия) (табл. 1). ПЦР проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США) по следующей программе: (1) 95 Выбрана °С в течение 5 мин, (2) 95 °С в течение 10 сек, (3) 60 °С в течение 10 сек, (4) второй-третий этапы повторялись 49 раз, (5) стадия плавления ДНК. Экспрессию исследуемых генов рассчитывали относительно экспрессии референсных генов β-Tubulin, RpL32, EF1α. Обработку данных осуществляли с помощью программного обеспечения CFX Manager 3.1 (Bio-Rad, США) и программы Statistica, версия 6.1 (StatSoft, США). Эксперименты проводили в трех биологических и трех технических повторностях.Результаты и их обсуждениеВлияние берберина и трихостатина А на продолжительность жизни дрозофилМы проанализировали изменение ПЖ дрозофил при применении широкого спектра концентраций берберина (1-5000 мкмоль/л) и трихостатин А (0.1-100 мкмоль/л) на протяжении всей жизни. Трихостатин А оказал положительное влияние на длительность жизни дрозофил. Он увеличивал медианную ПЖ самцов на 2–5 % (p < 0.001) и возраст 90 % смертности на 2 % (p < 0.001) при концентрациях вещества 0.1, 1 и 100 мкмоль/л. У самок показаны более значительные изменения при добавлении 0.1, 1 и 10 мкмоль/л трихостатина А - увеличение медианной ПЖ на 3–9 % (p < 0.001) и показателя максимальной ПЖ – на 8% (p < 0.001). Природное соединение берберин оказало положительное действие только на самок дрозофил, увеличив их медианную ПЖ на 2-3 % (p < 0.01) и возраст 90 % смертности на 1 % (p < 0.01). У самцов результаты были статистически незначимы (р > 0.05) или связаны с укорочением жизни (табл. 2, рис. 1).Влияние берберина и трихостатина А на устойчивость дрозофил к параквату и гамма-излучениюМы оценили влияние берберина и трихостатина А на устойчивость дрозофил к стрессорам: прооксиданту параквату в концентрации 20 ммоль/л и гамма-излучению в дозе 800 Гр. Для исследования выбрали концентрации изучаемых веществ, показавшие наибольший положительный эффект на ПЖ. Берберин и трихостатин А преимущественно не оказывали влияния на выживаемость самок в условиях воздействия параквата. Однако берберин в концентрации 1000 мкмоль/л снизил медианную выживаемость самцов на 8–10 % (р < 0.01) и максимальную – на 6 % (р < 0.05). Берберин в концентрациях 10 и 1000 мкмоль/л увеличил медианную выживаемость самцов на 25 % (р < 0.001) после острого действия гамма-излучения. В то же время трихостатин А повысил чувствительность самцов к генотоксическому воздействию, снизив выживаемость на 9–17 % (р < 0.001) (рис. 2). Действие берберина на радиоустойчивость самок оказалось статистически незначимым (р > 0.05), а трихостатин А снизил их выживаемость на 7 % (р < 0.01). Изменение экспрессии генов стресс-ответа у дрозофил после обработки берберином и трихостатином АУ мух, потреблявших берберин и трихостатин А анализировали экспрессию генов, участвующих в стресс-ответе, включая гены антиоксидантной защиты (Prx5, Sod2), гены ответа на повреждение ДНК и репарации ДНК (Gadd45, Rrp1, mus210, Brca2, okr, Ku80), а также генов протеостаза (Hsp68, Hsp83, Atg1, Atg5, Ire1). Берберин повышал активность гена Hsp68, кодирующего белок теплового шока 68, у самцов и самок в 2.6 и 1.7 раз (p < 0.05) соответственно. Кроме того, у самок наблюдалась активация транскрипции генов аутофагии Atg1 и Atg5 и гена ответа на стресс эндоплазматической сети Ire1 в 1.3-1.5 раз (p < 0.05) после потребления этого вещества. Трихостатин А активировал ген ответа на повреждение Gadd45 у самцов и самок, а также гены репарации ДНК Mus210, Brca2, Ku80 у самок в 1.5-3.0 раза (p < 0.05). Но у самцов наблюдалось подавление экспрессии Ku80 после применения этого вещества. В то же время действие трихостатина А на активность генов протеостаза оказалось противоположным у особей разного пола. У самок наблюдали повышение их активности, а у самцов - снижение, кроме гена Hsp68, который активировался у всех дрозофил в 2.1-2.2 раза (p < 0.05). Положительный эффект также был выявлен у самок в отношении гена Sod2 (p < 0.05) (рис. 3).В данном исследовании in vivo были сопоставлены эффекты берберина и трихостатина А на ПЖ Drosophila melanogaster, а также впервые изучено влияние этих веществ на устойчивость дрозофил к острому гамма-излучению и прооксиданту параквату. Положительное действие выбранных нами препаратов было показано ранее на различных модельных организмах. Берберин увеличивал длительность жизни дрожжей [27], мышей [27] и дрозофил [24, 25]. Трихостатин А также показал положительное влияние на ПЖ нематод [28], дрозофил [26] и мышей [29, 30]. В нашей работе мы подтвердили их геропротекторное действие, оба препарата продлили жизнь дрозофил, но более выраженный эффект был получен для трихостатина А, который увеличил ПЖ на 3-9 %. Различия в эффектах этих двух соединений могут быть обусловлены их разной биодоступностью [38, 39].Ионизирующие излучения являются одним из факторов, приводящих к повреждениям ДНК, образованию промежуточных продуктов репарации, мутациям [40]. Кроме того, они вызывают спектр эпигенетических изменений, вносящих вклад в состояние генетической нестабильности (изменение экспрессии генов, ацетилирования гистонов или паттернов метилирования ДНК) [41]. Паракват также способен нарушать целостность и стабильность генома, опосредованно через индукцию свободных радикалов. Он вызывает выраженную митохондриальную токсичность, индуцирует апоптоз, перекисное окисление липидов и тяжелое вторичное воспаление [42, 43].Согласно данным литературы, выбранные нами препараты – берберин и трихостатин А – оказывают защитное действие на клетки и организм в целом и могут стимулировать внутренние компенсаторные механизмы. В частности, трихостатин А способен активировать внутриклеточный сигнальный путь Akt/Nrf2 и усиливать антиоксидантную защиту в раковых клетках HeLa и HepG2 [44], а его положительное влияние на продолжительность жизни дрозофил может быть связано с активацией уровня экспрессии генов белков теплового шока [26, 45]. В исследовании на мышах трихостатин А оказывает кардиозащитное действие, через активацию сигнального пути FoxO3a и белков антиоксидантной защиты (SOD2, каталазы) [46]. Берберин повышал выживаемость дрозофил при высокой температуре [25]. У мышей этот алкалоид подавлял окислительный стресс и воспаление посредством сигнальных путей, включая NF-κB, AMPK и Nrf2 [47, 48]. В то же время имеются экспериментальные данные, указывающие на повышение чувствительности раковых клеток человека к ультрафиолетовому и ионизирующему излучению после обработки трихостатином [49-52] и берберином [53].Мы предположили, что оба вещества повысят выживаемость особей Drosophila melanogaster при воздействии параквата и гамма-излучения. Однако положительное действие оказал только берберин на радиоустойчивость самцов дрозофил, увеличив данный показатель на 25 %. Трихостатин А, напротив, снижал выживаемость дрозофил после действия острого гамма-излучения на 17 %. Для выяснения возможных молекулярных механизмов, обусловливающих наблюдаемые эффекты берберина и трихостатина А на уровне организма, мы оценили изменение экспрессии генов, вовлеченных в механизмы стресс-ответа, после применения веществ. Берберин преимущественно активировал гены протеостаза, особенно Hsp68. Продукт этого гена является одним из белков теплового шока – важных регуляторов ПЖ организма и ответа на повреждающие факторы. Они противодействуют накоплению аномальных белков, последствиям окислительного стресса и модулируют апоптоз (активируют его в случае избытка поврежденных макромолекул, либо обеспечивают выживание в стрессовых условиях) [54]. Повышенная экспрессия гена Hsp68 у дрозофил связана с долгожительством [55]. Тем не менее в некоторых моделях in vitro и in vivo берберин, напротив, подавлял гены и белки теплового шока и аутофагии [56-58].Трихостатин А повышал экспрессию гена ответа на повреждение ДНК Gadd45 и генов, отвечающих за разные механизмы репарации ДНК. Эффект в большей степени проявлялся у самок, для которых также был отмечен и больший эффект на ПЖ. В экспериментах на клеточных культурах ранее была установлена способность данного вещества стимулировать клеточный ответ на повреждение ДНК через ингибирование деацетилаз и изменение конформации хроматина [59-62]. Стоит отметить, что повышенная экспрессия генов репарации ДНК (включая Gadd45) может быть связана с продлением жизни организма [63, 64]. При этом она сопровождается выраженным повышение радиочувствительности [65]. Возможно, что негативный эффект трихостатина А на устойчивость к острому гамма-излучению отчасти обусловлен избыточной активацией и нарушением баланса систем ответа на повреждение ДНК.У самок, получавших трихостатин А, также наблюдалась активация гена антиоксидантной защиты Sod1 и генов протеостаза. Ранее в исследованиях на дрозофиле было показано, что трихостатин А через регуляцию ацетилирования гистонов способен стимулировать экспрессию генов, связанных с ответом на повреждение белков, например Hsp22 и Hsp70 [26, 45], что также подтверждают полученные данные на культурах клеток человека [66]. В то же время трихостатин А оказывал разнонаправленное действие на экспрессию большинства анализируемых генов стресс-ответа у самцов и самок, и схожую тенденцию для радиоустойчивости дрозофил. Половые различия могут быть обусловлены взаимодействием ингибитора HDAC с гормонами, регулирующими размножение и развитие организма. Например, в исследованиях на грызунах описана обратная связь между эпигенетическими модификациями и половыми гормонами (эстрадиолом и лютеинизирующим гормоном), которая определяет состояние здоровье и старение [67, 68]. Также установлено, что ацетилирование и деацетилирование гистонов важны для регуляторной активности ювенильного гормона у дрозофилы, а трихостатин А способен влиять на экспрессию ряда генов, опосредующих действие этого гормона [69]. Таким образом, нами показаны потенциальные геро- и радиопротекторные эффекты трихостатина А и берберина на модели D. melanogaster. Трихостатин А оказал положительное влияние на длительность жизни дрозофил, но повысил их чувствительность к острому гамма-излучению. Берберин при небольшом увеличении продолжительности жизни значительно повысил выживаемость самцов при радиационном воздействии.